단백질 기반 SEC Method에서 피크 테일링 및/또는 낮은 분리능(브로드 피크)의 일반적인 원인은 무엇입니까? - WKB230675

환경

크기 배제 크로마토그래피(SEC)
피크 테일링(Peak tailing)
ACQUITY
UltraPerformance Liquid Chromatography(UPLC)
BEH(Bridged Ethylene Hybrid)
MaxPeak Premier
컬럼

답변

피크 테일링 및/또는 낮은 분리능의 일반적인 원인은 다음과 같습니다(이에 국한되지 않음).

미생물 오염
- 이는 SEC 분리에서 가장 일반적인 문제 중 하나입니다.
  - SEC 분리에 대한 미생물 오염의 부정적인 영향에 대해 논의한 섹션은 Guide to Size-Exclusion Chromatography (SEC) of mAb Aggregates, Monomers, and Fragments("mAb 응집체, 단량체 및 조각의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 안내서")를 참조하십시오.
샘플 흐름 경로에 Teflon(PTFE)이 있습니다.
- Teflon은 소수성이 매우 높기 때문에 단백질이 Teflon에 흡수되어 테일링 문제를 일으킬 수 있습니다.
- Teflon Flow cell(흐름 셀)이 사용되는 경우, 스테인리스 또는 티타늄 흐름 셀로 전환하여 이 문제를 해결하십시오.
시스템 분산(대역 확산, 띠 넓어짐)이 너무 높습니다.
- 주입기와 검출기 사이의 시스템 부피가 너무 크면 피크가 넓어지고 때로는 이로 인해 테일링이 발생할 수 있습니다.
  - 기존 Flow cell(흐름 셀)과 비교하여 부피가 더 큰 새 Flow cell(흐름 셀).
  - 기존 튜빙에 비해 부피가 더 큰 새 튜빙.
- 흐름 경로의 연결 상태가 불량하면 테일링을 포함한 피크 모양 문제가 발생할 수 있습니다.
  - 페룰(Ferrule) 깊이가 너무 짧으면 엔드 피팅(Fitting) 내부에 보이드(void)가 발생할 수 있습니다.
  - 페룰(Ferrule)이 미끄러졌습니다(튜빙이 엔드 피팅(Fitting) 내부로 미끄러져 보이드(void)가 발생할 수 있음).
비특이적 바인딩:
- 단백질은 스테인리스의 양전하에 대한 이온성 인력을 통해 스테인리스 표면에 흡착되어 테일링을 일으킬 수 있습니다.
- 단백질은 소수성 인력에 의해 SEC 입자에 흡착될 수 있습니다.
  - 원치 않는 비특이적 흡착을 방지하기 위해 biomolecule를 여러 번 주입하여 스테인리스 스틸(MaxPeak Premier가 아닌 하드웨어) 및 입자 활성 부위를 포화시킵니다. ACQUITY UPLC Protein BEH SEC 컬럼에 컨디셔닝을 주입하는 방법을 설명하는 ACQUITY UPLC BEH SEC Columns and Standards Care & Use Manual("ACQUITY UPLC BEH SEC 컬럼 및 표준물질 관리 및 사용 설명서")의 3페이지를 참조하십시오.
- Waters는 이제 스테인리스 스틸이나 입자에 대한 비특이적 흡착을 방지하도록 설계된 ACQUITY Premier Protein SEC 250A 및 XBridge Premier Protein SEC 250A 컬럼을 제공합니다.
컬럼 헤드의 미립자 축적:
- 미생물 증식/오염:
  - 이는 피크 테일링을 일으킬 수 있지만, 더 자주 볼 수 있는 문제는 분할 피크 또는 낮은 분리능 및 고압 문제입니다.
    - 2 ~ 3일마다 이온 세기가 낮은 이동상(<150mM)을 교체하십시오.
    - 2주마다 이온 세기가 높은 이동상(>150mM)을 교체하십시오.
- 부형제(예: 폴리소르베이트 80) 및 기타 매트릭스 성분:
  - 패킹에 흡착되어 분해능이 낮아질 수 있습니다.
소수성 2차 상호 작용:
- 피크 테일링이 생성됩니다.
  - 유기 공용매는 소수성 2차 상호 작용을 완화하기 위해 SEC 이동상에서 일반적으로 사용됩니다. 유기 변형제가 사용되는 경우, 이러한 컬럼에 권장되는 용매는 이소프로판올(IPA)입니다.
    - 이동상 조성의 5% 이하 농도로 시작하여 필요한 경우에만 최대 15%까지 높입니다.
냉장고의 컬럼 저장매체:
- 컬럼 성능이 저하될 수 있습니다.
  - Waters에서는 ACQUITY UPLC Protein BEH SEC, XBridge Protein BEH SEC, ACQUITY Premier Protein SEC 250A 및 XBridge Premier Protein SEC 250A 컬럼과 같은 SEC 컬럼을 냉장고에 보관하지 않을 것을 권장합니다.
    - 대신 이러한 컬럼을 실온에서 10% 아세토니트릴/90% 25mM 인산 나트륨 pH 7.0 + 100mM KCl에 보관합니다.
최적이 아닌 컬럼 저장 용매:
- 대신 이러한 컬럼을 실온에서 10% 아세토니트릴/90% 25mM 인산 나트륨 pH 7.0 + 100mM KCl에 보관할 것을 권장합니다.
  - 20% 메탄올에 보관할 경우 고분자량 종의 분리능 및 저분자량 종의 분리능이 저하될 수 있습니다.
    - 자세한 내용은 장기 보관 중 크기 배제 크로마토그래피의 컬럼 성능 유지를 위한 권장사항을 참조하십시오

추가 정보

참고 항목:

Guidelines for Routine Use and Maintenance of Ultra-Performance Size-Exclusion and Ion-Exchange Chromatography Systems (Technology Brief)("초 고성능 크기 배제 및 이온 교환 크로마토그래피 시스템의 일상적인 사용 및 유지 관리 지침")(기술서)
- 이 문서에서는 다음과 같은 예를 보여줍니다.
  - Teflon을 포함한 Flow cell(흐름 셀)이 피크 테일링을 유발히는 방법.
  - 미생물 오염이 SEC의 효율성을 감소시키는 방법.
Guide to Size-Exclusion Chromatography (SEC) of mAb Aggregates, Monomers, and Fragments("mAb 응집체, 단량체 및 조각의 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 안내서")
- 이 문서에서는 다음에 대해 설명합니다.
  - 탄탄한 LC 기반 SEC 분석법 개발의 중요성:
    - 적합한 BEH SEC 컬럼 선택.
    - 분석법 개발.
  - SEC 분리 중 테일링 발생 및/또는 분리능이 감소할 때 고려사항:
    - ACQUITY UPLC Protein BEH SEC 컬럼과 LC 시스템의 연결.
    - UPLC SEC 분리에 대한 LC 시스템 분산 효과.
    - LC 시스템 분산 부피 측정.
  - Protein BEH SEC 컬럼 수명 극대화:
    - 이동상 준비와 사용.
    - 용매 이송 시스템의 미생물 오염 방지.
    - ACQUITY UPLC 시스템 세척.
    - Protein BEH SEC 컬럼의 샘플 입자 오염 최소화.
    - Protein BEH SEC 컬럼의 샘플 제형 성분 오염 최소화.
    - 컬럼 보관.
단백질의 크기 배제 크로마토그래피 분석에 대한 LC 시스템 분산의 영향 평가
- 이 문서에서는 다음에 대해 설명합니다.
  - LC 시스템 분산 측정의 이해.
  - LC 시스템 분산이 SEC 기반 단백질 분리에 미치는 영향에 대한 교육적이고 체계적인 입증.
  - 최적의 SEC 컬럼 설정 선택에 대한 지침은 다음을 기준으로 합니다.
    1. 사용할 LC 시스템.
    2. 분석법 요구 사항은 다음을 포함합니다.
      - 분리능
      - 감도
      - 재현성
      - 전환 능력
단일클론 IgG 항체 응집체 및 조각의 크기 배제 크로마토그래피 분석에 대한 LC 시스템 분산의 영향: Method에 적합한 컬럼 설정 선택
- 이 문서에서는 다음에 대해 설명합니다.
  - LC 시스템 분산이 SEC 기반 mAb 분리에 미치는 영향에 대한 교육적이고 체계적인 입증.
  - 최적의 SEC 컬럼 설정 선택에 대한 지침은 다음을 기준으로 합니다.
    1. 사용할 LC 시스템.
    2. 분석법 요구 사항은 다음을 포함합니다.
      - 분리능
      - 감도
      - 재현성
      - 전환 능력
  - ACQUITY UPLC H-Class Bio(UPLC)와 ACQUITY Arc Bio(UHPLC) 시스템의 SEC 분리 성능을 비교합니다.