HDX 역교환(back-exchange)을 테스트하는 방법 - WKB97409

목적 또는 목표

HDX 역교환을 테스트합니다.

HDX에서 흔히 볼 수 있는 효과인 양성자에 대한 중수소 역교환은 여러 가지 원인이 있을 수 있습니다. 퀀칭(Quenching) 용액 및 버퍼에 물과 수소가 자연적으로 존재하는 경우, 이동상 또는 버퍼의 pH가 적합하지 않은 경우, HDX Manager 또는 ESI 소스에서 사용되는 권장 온도보다 높은 경우, 또는 주입 및 샘플 처리가 지연되는 경우 등입니다. System Suitability Test의 일부로, 역 교환은 phosphorylase b의 tryptic digest(MassPREP Phosphorylase b 표준물질 - 186002326 참조)를 분석하여 평가할 수 있습니다.

환경

• SYNAPT G2-S
• SYNAPT G2-Si
• SYNAPT XS
• Xevo G2-S
• Xevo G2-XS

절차

샘플을 250µl의 100% D₂O에서 재용매화시켜 모든 펩타이드가 완전히 라벨링될 수 있도록 밤새 배양합니다.

1. 그런 다음 평형, 퀀칭(Quenching), 시스템 주입(펩신 컬럼 제외) 등의 정상적인 라벨링 실험이 수행되고, 펩타이드에 남아 있는 라벨링의 백분율을 평가합니다.
2. 해당 펩타이드의 총 아미드 수소 수에서 측정된 중수소 값을 빼서 역교환(back-exchange)을 계산합니다. 관심 단백질의 역교환과 비교하여 약간 다른 역교환 값이 관찰될 수 있습니다. 이는 단백질의 3차 구조와 아미노산 서열 또는 용리 순서의 위치 차이 때문입니다. 이는 시스템의 역 교환 징조에 대한 좋은 표시를 제공합니다. DynamX의 Relative Uptake 플롯에는 최대 중수소화는 y값을 사용합니다. 예상 값은 40% 미만이어야 합니다.

추가 정보

참조 tryptic digest 데이터: 온라인 소화성 분해 및 트래핑 매개 변수가 예상되는 역교환을 재현하기 위해 70µL/분으로 3분 동안 유지되었습니다. 중수소화 노출 시간은 30분과 2시간이었습니다.

펩타이드 235-242, 상대적 분획 흡수의 약 70%가 유지되었습니다.

펩타이드 248-255, 상대적 분획 흡수의 약 60%가 유지되었습니다.

펩타이드 364-370, 상대적 분획 흡수의 약 64%가 유지되었습니다.

역교환이 40%를 초과하는 것으로 확인되면 다음을 권장합니다.

1. 새 용매와 버퍼를 준비하고 검량된 pH 측정기를 사용하여 pH를 매우 조심스럽게 조정합니다.

2. HDX Manager의 온도를 확인하고 냉각 효율이 충분히 높은지 확인합니다. 고온에서 역교환이 증가함을 알아두십시오.

3. 소스 온도(80–100ºC) 및 디졸베이션 온도(250ºC)를 확인합니다.

4. MS 설정, 특히 StepWave와 관련된 설정을 수정합니다.

매개 변수	최적화된 값
Stepwave 1 wave height (V)	30
Stepwave 1 Velocity (m/s)	300
Stepwave 2 Wave height (V)	30
Stepwave 2 Velocity (m/s)	200
Stepwave 2 offset (V)	15
Diff Aperture 1 offset (V)	3
Diff Aperture 2 offset (V)	0
Stepwave rf Voltage (V)	300
Cone gas flow rate (L/h)	90

자세한 내용은 Guttman et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2016, 27, 4, 662–668를 참조하십시오.